3.用于基于靶向的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析的微流體系統(tǒng)

在靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中，蛋白質(zhì)是通過(guò)使用帶有傳感標(biāo)簽（如共軛熒光團(tuán)、同位素標(biāo)簽或量子點(diǎn)）的親和探針進(jìn)行分析的，這些探針會(huì)發(fā)射或轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度并促進(jìn)單細(xì)胞水平的靶向蛋白質(zhì)組織學(xué)鑒定，微流體的使用越來(lái)越多，主要是因?yàn)樗鼈兲峁┝藰?biāo)記過(guò)程中更高的有效濃度、可控的細(xì)胞操作、大大減少的試劑消耗以及提高多路復(fù)用性和吞吐量的設(shè)計(jì)靈活性等優(yōu)點(diǎn)。在下文中，我們回顧了微流體系統(tǒng)支持的基于靶向的SCP方法，特別關(guān)注了它們?cè)谶^(guò)去5年的發(fā)展，因?yàn)樗鼈兊脑缙诎l(fā)展在之前的綜述中已經(jīng)討論過(guò)。

3.1基于細(xì)胞計(jì)量學(xué)的單細(xì)胞方法

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是一種標(biāo)準(zhǔn)的分析技術(shù)，通過(guò)量化單個(gè)細(xì)胞的熒光發(fā)射和散射光，每秒可以計(jì)數(shù)和分析數(shù)千個(gè)細(xì)胞。使用FCM和熒光抗體來(lái)分析細(xì)胞中的蛋白質(zhì)一直是生物科學(xué)的主流和廣泛應(yīng)用。然而，F(xiàn)CM的細(xì)胞內(nèi)空間信息有限，通常需要數(shù)十到數(shù)百μL的樣本量。當(dāng)將流式細(xì)胞儀縮小到微流體尺寸時(shí)，多參數(shù)測(cè)量的帶寬會(huì)受到損害，例如，在高通量設(shè)置（>2000個(gè)細(xì)胞/秒）下表征細(xì)胞形態(tài)是一項(xiàng)挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，成像流式細(xì)胞術(shù)（IFC）結(jié)合了高通量FCM和高分辨率成像顯微鏡的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞信息豐富的檢測(cè)（圖3a）。此外，IFC與微流體的集成允許簡(jiǎn)單的光學(xué)實(shí)現(xiàn)和對(duì)細(xì)胞操作的精細(xì)控制。請(qǐng)注意，在大多數(shù)IFC微系統(tǒng)中，流體通量和光學(xué)檢測(cè)之間的權(quán)衡為在高通量下獲得體面的空間分辨率帶來(lái)了挑戰(zhàn)。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Holzner等人引入了使用多色熒光和亮場(chǎng)分析的多參數(shù)IFC，該方法能夠高分辨率和高通量地提取細(xì)胞形態(tài)特征，如準(zhǔn)確的細(xì)胞大小和檢測(cè)人類(lèi)細(xì)胞中的細(xì)胞質(zhì)蛋白。該方法將頻閃照明（即一種為高速運(yùn)動(dòng)的物體生成無(wú)模糊圖像的技術(shù)）與彈性慣性3D細(xì)胞聚焦相結(jié)合，分別有效地控制流速和細(xì)胞定位，從而實(shí)現(xiàn)每秒104個(gè)細(xì)胞的采集率。

3.2微蝕刻法

微重力法利用亞納升孔捕獲細(xì)胞，細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)被預(yù)處理的載玻片捕獲，載玻片上涂有親和探針（抗體或抗原）。Love等人開(kāi)創(chuàng)了微重力生物芯片，其中微孔是通過(guò)沉積細(xì)胞懸浮液制備的，使細(xì)胞在去除多余的未被追蹤的細(xì)胞之前沉淀下來(lái)（圖3b）。然后將刻有抗體或抗原的載玻片貼在封閉的單細(xì)胞上，并通過(guò)熒光免疫測(cè)定法檢測(cè)分泌的蛋白質(zhì)。Schubert等人開(kāi)發(fā)了一種單分子陣列（SiMoA）平臺(tái)，該平臺(tái)能夠?qū)蝹€(gè)細(xì)胞中的少量蛋白質(zhì)進(jìn)行計(jì)數(shù)。SiMoA表明，前列腺特異性抗原的表達(dá)在前列腺癌癥細(xì)胞中不同，并隨著基因漂移而變化。Jia等人探索了微雕刻方法來(lái)研究非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)合疫苗的縱向回憶反應(yīng)。自首次亮相以來(lái)，不斷努力提高微雕刻方法的靈敏度，推動(dòng)了從單細(xì)胞中檢測(cè)低豐度蛋白質(zhì)。Li等人介紹了一種在蛋白質(zhì)檢測(cè)中使用微孔平臺(tái)的信號(hào)放大方法，其中光學(xué)的軸向分辨率（即深度場(chǎng)）得到了提高，側(cè)壁和邊緣捕獲的熒光標(biāo)簽也對(duì)信號(hào)做出了貢獻(xiàn)。與僅從平面發(fā)出熒光的傳統(tǒng)微重力方法相比，值得注意的是，邊緣增強(qiáng)微孔免疫測(cè)定將靈敏度提高了6倍。增強(qiáng)熒光的另一種方法是用半導(dǎo)體量子點(diǎn)代替有機(jī)染料，半導(dǎo)體量子點(diǎn)可用作熒光報(bào)告器來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞分泌的蛋白質(zhì)。總之，基于微孔的檢測(cè)比傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)（ELISpot）檢測(cè)具有更高的靈敏度。此外，這種方法還具有適用于下游分析的細(xì)胞分離等優(yōu)點(diǎn)，并能夠通過(guò)多抗體雕刻的載玻片對(duì)單細(xì)胞分泌體進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究。

3.3微流控毛細(xì)管電泳和單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡

毛細(xì)管電泳（CE）是一種分析方法，其特點(diǎn)是使用高電場(chǎng)進(jìn)行高分離效率和靈敏的離子檢測(cè)。傳統(tǒng)的CE存在分離時(shí)間長(zhǎng)、樣品消耗大和焦耳熱耗散慢的問(wèn)題。另一方面，微流體CE（MCE）能夠解決這些局限性。MCE使用微通道在納升尺度上對(duì)生物分子進(jìn)行電泳分離，分析時(shí)間需要數(shù)十秒，可用于分離和檢測(cè)從單細(xì)胞中提取的細(xì)胞內(nèi)內(nèi)容物。Huang等人開(kāi)發(fā)了一種MCE，通過(guò)使用單分子熒光測(cè)量來(lái)檢測(cè)單細(xì)胞中的低拷貝數(shù)（LCN）蛋白質(zhì)。請(qǐng)注意，這種方法的吞吐量相對(duì)較低，多路復(fù)用能力有限。為了提高通量，Mainz等人利用光可編程和細(xì)胞可滲透的報(bào)告器同時(shí)分析單個(gè)細(xì)胞的激酶活性。 Li等人還提出了一種基于多色熒光檢測(cè)的微流體裝置，用于單細(xì)胞操作，該裝置提供了有效的電泳分離，以實(shí)現(xiàn)多個(gè)小分子的同時(shí)檢測(cè)。總體而言，MCE利用短距離和相對(duì)較短的時(shí)間尺度，可以快速完成傳統(tǒng)CE中采取的所有步驟。

微流體中使用的另一種電泳方法是A.Herr小組開(kāi)發(fā)的單細(xì)胞蛋白質(zhì)印跡（scWB），其中特定蛋白質(zhì)的鑒定和定量取決于它們通過(guò)與抗體探針結(jié)合的薄層凝膠基質(zhì)的遷移（圖3d）。scWB將蛋白質(zhì)印跡與開(kāi)放式微孔陣列相結(jié)合，從而提高了檢測(cè)通量，并能夠可靠地處理約2000個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞。請(qǐng)注意，scWB的早期發(fā)展主要集中在處理大量輸入細(xì)胞，例如>1000個(gè)輸入細(xì)胞，因此無(wú)法處理質(zhì)量有限的輸入細(xì)胞。為了解決這個(gè)問(wèn)題，Sinkala等人將稀有細(xì)胞工作流程與scWB相結(jié)合，以分析單個(gè)循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）的蛋白質(zhì)表達(dá)（復(fù)雜性=8）。具體來(lái)說(shuō)，從患者血液中收集的細(xì)胞根據(jù)大小和變形性進(jìn)行選擇，對(duì)大有核細(xì)胞進(jìn)行染色和鑒定，然后轉(zhuǎn)移到微孔中。然后裂解這些細(xì)胞，將相關(guān)蛋白電泳注射到凝膠中，依次進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、印跡和免疫印跡步驟。最近，差異分級(jí)被整合到電泳分離中：特別是，J.Vlassakis等人通過(guò)電泳和免疫測(cè)定讀數(shù)（SIFTER）引入了單細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用分級(jí)，用于定量單細(xì)胞中的多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物。在這項(xiàng)工作中，進(jìn)行了雙向電泳，單體和解聚的蛋白質(zhì)復(fù)合物被分級(jí)并固定在微孔周?chē)哪z區(qū)域，然后使用凝膠內(nèi)免疫探針進(jìn)行定量。除了高通量和負(fù)擔(dān)得起的多重性的優(yōu)點(diǎn)外，scWB還由于電泳分離而提高了抗體的特異性。

3.4液滴微流體

液滴微流體技術(shù)能夠通過(guò)在納升體積的液滴中用熒光探針進(jìn)行液滴包封來(lái)定量單個(gè)細(xì)胞釋放的分泌體，克服了微流體FCM無(wú)法檢測(cè)分泌蛋白的技術(shù)限制。液滴微流控技術(shù)也被用于分析細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，其中一到三個(gè)細(xì)胞在液滴形成之前被電裂解。丁等人最近使用共流液滴微流技術(shù)將原代細(xì)胞（取自組織）與捕獲微珠和熒光標(biāo)記抗原一起包封（圖3e）。在液滴孵育過(guò)程中，所需的細(xì)胞（如B細(xì)胞）分泌第一抗體，以介導(dǎo)熒光團(tuán)標(biāo)記的抗原與微珠之間的結(jié)合。隨后，通過(guò)熒光信號(hào)對(duì)被熒光抗原“標(biāo)記”的所需液滴進(jìn)行分選（圖3e）。液滴微流控方法可實(shí)現(xiàn)高通量分析；然而，檢測(cè)珠（在焦平面上）的排列使得對(duì)分泌的抗體進(jìn)行定量變得具有挑戰(zhàn)性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，通過(guò)在液滴產(chǎn)生后將熱固性油的包封轉(zhuǎn)化為固體來(lái)證明液滴的固定化。另一方面，Eyer等人引入了一種基于液滴的微流體技術(shù)（DropMAP），從固定在2D陣列上的液滴中引出單細(xì)胞分析。DropMAP能夠?qū)崟r(shí)測(cè)量以量化抗體分泌率、免疫親和性和相關(guān)動(dòng)力學(xué)。關(guān)于DropMAP的工作原理，包封了兩個(gè)水相，其中一個(gè)包含細(xì)胞或校準(zhǔn)抗體，另一個(gè)包含試劑（熒光標(biāo)記和300 nm順磁性納米顆粒）。由于使用了納米顆粒，抗體的結(jié)合能力得到了提高。當(dāng)施加磁場(chǎng)時(shí)，納米粒子（旨在捕獲分泌的免疫球蛋白）交聯(lián)，形成微米大小的聚集體。為了促進(jìn)單個(gè)細(xì)胞在液滴內(nèi)的封裝并提高多路復(fù)用性，Khajvand等人將液滴微流體與抗體條形碼集成在一起。使用約180 pL大小的腔室陣列來(lái)提高單細(xì)胞捕獲效率（超過(guò)80%，存活率>90%），這種方法大大提高了固定液滴中單細(xì)胞的片上捕獲、分離和長(zhǎng)期培養(yǎng)。一般來(lái)說(shuō)，基于液滴的微流體具有快速包封、提高靶濃度、減少樣品之間的交叉污染以及橋接基因型和表型的能力。

4.基于質(zhì)譜的全球單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)

已經(jīng)投入了大量努力來(lái)提高非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)工作流程的靈敏度，以達(dá)到具有良好覆蓋率、魯棒性和可靠性的單細(xì)胞分辨率。與基于親和力的方法相比，非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)分析允許對(duì)細(xì)胞蛋白質(zhì)組進(jìn)行全局映射，因此是面向發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)研究和臨床研究的理想選擇。各種樣品制備方法、自動(dòng)化儀器和LC-MS開(kāi)發(fā)的最新進(jìn)展使我們能夠使用無(wú)標(biāo)記方法對(duì)單個(gè)細(xì)胞中的1000多種蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。在下文中，我們將討論這些令人興奮的發(fā)展，其中包括簡(jiǎn)要討論用于單細(xì)胞分析的LC-MS系統(tǒng)的演變、微流體支持的上游樣品處理以及隨后的數(shù)據(jù)采集和分析工作流程（圖4）。

5.SCP在生物學(xué)和臨床研究中的應(yīng)用

5.1靶向單細(xì)胞蛋白測(cè)定的應(yīng)用

在本節(jié)中，我們介紹了各種基于微流體的靶向SCP檢測(cè)的生物學(xué)和臨床應(yīng)用（圖5。由于微流體的獨(dú)特能力，它們對(duì)靶向SCP的實(shí)施促進(jìn)了各種細(xì)胞生物學(xué)研究和臨床研究。例如，CyTOF是靶向SCP分析最廣泛使用的方法之一，提供了探索不同腦細(xì)胞中細(xì)胞表型的應(yīng)用（基于信號(hào)標(biāo)記物和細(xì)胞因子），免疫細(xì)胞分化，基于表面標(biāo)記物的細(xì)胞異質(zhì)性，和癌癥相關(guān)信號(hào)。CyTOF與細(xì)胞成像相結(jié)合，也被應(yīng)用于探索組織內(nèi)或細(xì)胞過(guò)程中單個(gè)細(xì)胞中蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞分布，促進(jìn)了我們對(duì)免疫細(xì)胞功能的理解，以用于免疫治療應(yīng)用。最近，Neuperger及其同事使用單細(xì)胞CyTOF進(jìn)行了研究?；?3種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NSCLC）系中的異質(zhì)性和肺腺癌中的瘤內(nèi)異質(zhì)性。同樣，SCBC方法用于測(cè)量各種分泌、細(xì)胞質(zhì)或膜蛋白的多重蛋白質(zhì)豐度（由細(xì)胞產(chǎn)生的拷貝數(shù)決定）。通過(guò)仔細(xì)選擇和監(jiān)測(cè)特定蛋白質(zhì)標(biāo)記的表達(dá)，SCBCs可以成為研究多種生物系統(tǒng)的工具。例如，異質(zhì)性（細(xì)胞-細(xì)胞變異）可以通過(guò)監(jiān)測(cè)參與不同信號(hào)通路的關(guān)鍵表型標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)效應(yīng)器的差異表達(dá)來(lái)解決。SCBC方法也被用于通過(guò)測(cè)量在近距離孵育的細(xì)胞釋放的分泌蛋白來(lái)探索細(xì)胞相互作用和通信。這種方法用于了解細(xì)胞在不同分離條件下如何相互作用，以及信號(hào)蛋白如何影響相鄰細(xì)胞。選擇性蛋白質(zhì)標(biāo)記的SCBC分析確實(shí)已成為研究功能異質(zhì)性、信號(hào)通路、細(xì)胞間相互作用、細(xì)胞通訊、免疫細(xì)胞反應(yīng)、和CTC分析的有前景的工具。Su等人應(yīng)用SCBC芯片監(jiān)測(cè)了18種蛋白質(zhì)，包括表型標(biāo)記、轉(zhuǎn)錄因子、單個(gè)黑色素瘤細(xì)胞中的信號(hào)效應(yīng)器，以探索藥物誘導(dǎo)的信號(hào)動(dòng)力學(xué)。這項(xiàng)研究揭示了黑色素瘤在BRAF抑制劑治療下的表型轉(zhuǎn)變，BRAF抑制劑激活了包括MEK/ERK和NF-κB在內(nèi)的替代通路，進(jìn)一步加速了腫瘤進(jìn)展和耐藥性。表型。此外，Ullal及其同事使用SCBC探索了肺腺癌患者的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，并仔細(xì)選擇了90個(gè)靶標(biāo)記，以覆蓋臨床上使用的標(biāo)志性途徑（如DNA損傷、細(xì)胞死亡）和診斷標(biāo)記。

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