殺菌劑在農(nóng)業(yè)中廣泛用于控制真菌病原體，這些病原體對植物產(chǎn)量和質(zhì)量產(chǎn)生重大經(jīng)濟影響。傳統(tǒng)的抗真菌篩選技術(shù)，如水瓊脂和 96 孔板，基于費力的方案和批量分析，限制了單孢子水平的分析，并且非常耗時。在這項研究中，我們提出了一種基于液滴的微流控平臺，可以對絲狀真菌鏈格孢的單個孢子進行抗真菌分析。開發(fā)了一種基于液滴的活力測定法，允許液滴內(nèi)單個互花米孢子的萌發(fā)和菌絲生長。在24 h的時間內(nèi)證明了活力，并使用Kunshi/Tezuma作為抗真菌劑進行了抗真菌篩選。將基于液滴的抗真菌分析的療效結(jié)果與常規(guī)方案的結(jié)果進行比較和驗證。基于液滴的平臺評估的抑制百分比與其他兩種方法獲得的抑制百分比相同，Pearson相關(guān)性分析顯示三種檢測之間的高度相關(guān)性。綜上所述，這種基于液滴的微流控平臺為分析殺菌劑抗性發(fā)展以及其他抗菌劑甚至拮抗真菌的組合篩選提供了廣泛的潛在應(yīng)用。

植物病原真菌每年破壞三分之一的糧食作物，造成經(jīng)濟損失并影響全球貧困。在這些植物病原真菌中，鏈格孢菌會引起馬鈴薯作物的褐斑病。褐斑病，俗稱“另一種早疫病”，是馬鈴薯的一種重要病害。癥狀包括出現(xiàn)在葉子背面的小圓形棕色病變。該病有可能使產(chǎn)量降低多達 30%，當(dāng)病害得不到控制時，還報告了高達 70-80% 的損失。在儲存過程中，互花米草會在塊莖上造成黑坑，導(dǎo)致收獲后損失 10%。幾種殺菌劑用于控制疾病、提高生產(chǎn)力和延長收獲作物的儲存壽命。大量使用特定地點的殺菌劑會導(dǎo)致互花米草和各種其他真菌產(chǎn)生殺菌劑抗性，這需要發(fā)現(xiàn)新的抗真菌劑。新殺菌劑的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)面臨著巨大的挑戰(zhàn)，包括 （a） 篩選大型抗真菌候選藥物庫以評估其功效、植物毒性和其他可能的影響，（b） 廣泛的研究推動的產(chǎn)品開發(fā)成本高昂，以及 （c） 復(fù)雜的體外和體內(nèi)實驗。一種新的作物保護產(chǎn)品大約需要 10 年時間，開發(fā)成本約為 2.6 億美元。對于抗真菌篩選，使用各種常規(guī)技術(shù)，包括瓊脂平板和 96 孔平板。然而，不同的分析方法可能會導(dǎo)致不同的靈敏度，影響測試結(jié)果的可靠性和可用性，從而影響“真正的命中”作為針對特定真菌的抗真菌劑的選擇。敏感性的差異可能會根據(jù)觀察到的殺菌劑反應(yīng)得出有偏差的結(jié)論，并取決于所使用的方案。此外，多孔平臺的一些主要局限性是所需的昂貴實驗試劑和耗材的數(shù)量、耗時費力的方案以及封閉的系統(tǒng)設(shè)計。經(jīng)典方法在單孢子分析方面也存在局限性，并且處理和可重復(fù)性等特殊困難可能導(dǎo)致實驗運行中觀察結(jié)果之間的相當(dāng)大的差異。因此，重要的是要建立一種新的經(jīng)過驗證的標(biāo)準(zhǔn)化抗真菌分析方法，以克服這些限制。

微流控方法的進步推動了尋找專門針對抗真菌劑的新分子靶點的搜索。在過去的二十年中，微流控技術(shù)一直是人們關(guān)注的焦點，因為它與傳統(tǒng)檢測相比具有優(yōu)勢，例如（a）將臺式實驗室縮小到芯片，（b）試劑消耗低，（c）高通量（HT）分析，（d）縮短分析時間，（e）監(jiān)測高空間和時間分辨率，（f）觀察許多細胞的動態(tài)行為（g） 提供有關(guān)異質(zhì)微生物群體中細胞間變異的信息 和 （h） 研究真菌之間的菌絲相互作用。這些優(yōu)點使微流控設(shè)備成為抗真菌篩選和分析的多功能工具。在不同的微流控方法中，基于液滴的微流控技術(shù)已成為傳統(tǒng)微量滴定板方法的一種越來越有趣的替代方案，用于真菌的酶促HT篩選。這些方法可以為單孢子封裝提供另一種方法，并有可能成為大規(guī)?？拐婢治龅挠辛ぞ?。盡管基于液滴的微流控具有快速、經(jīng)濟高效的HT篩選的潛力，但目前尚未用于常規(guī)抗真菌測試和分析，這很可能是考慮到技術(shù)困難，例如不同的培養(yǎng)表面、減少的培養(yǎng)基體積以及微流控工具所代表的培養(yǎng)基交換速率和方法大不相同對于大多數(shù)有經(jīng)驗的植物生物學(xué)家來說。重要的是，將植物病原真菌的單個孢子封裝到液滴中，被視為微反應(yīng)器，可以防止惡劣的外部環(huán)境條件，使孢子的物理和化學(xué)分離成為可能，并減少被外來生物污染的機會。此外，通過向液滴中注射不同的試劑選擇性地提供營養(yǎng)物質(zhì)或抗真菌劑，通過增強對微環(huán)境的動態(tài)控制，可以在單個孢子水平上觀察殺菌劑分子機制，從而獲得對殺菌劑分子機制的新見解。如今，有各種成熟的封裝單個孢子的技術(shù)，包括逐層沉積、溶劑蒸發(fā)和界面聚合。然而，這些技術(shù)使用各種細胞毒性化合物、腐蝕性化學(xué)品或有機溶劑，這會危及封裝生物的活力。因此，基于液滴的方法應(yīng)對這些挑戰(zhàn)并使用生物相容性試劑可能有可能逐步過渡到單孢子分析，以進行常規(guī)測定的抗真菌篩選，這最終可能會徹底改變殺菌劑的開發(fā)方式以及如何控制真菌中的殺菌劑耐藥性。

本研究的主要目的是建立一種簡單的微流體裝置，能夠 （a） 封裝真菌的單個孢子，（b） 進行抗真菌分析，以及 （c） 量化基于梯度的抗真菌劑量反應(yīng)。本文描述的平臺允許在密閉的微環(huán)境中評估抗真菌劑對孢子萌發(fā)的直接影響，具有高可重復(fù)性，并且能夠使用廣泛可訪問的顯微鏡圖像分析對孢子萌發(fā)進行定量。我們的設(shè)計結(jié)合了微米級的陷阱，這些陷阱限制了封裝的孢子，允許它們隨著時間的推移通過明場顯微鏡進行個體可視化和評估。為了驗證使用微流控平臺的抗真菌評估結(jié)果，我們還使用兩種常規(guī)方法進行了評估實驗，即水瓊脂 （WA） 和 96 微量滴定板。在本研究中，我們展示了具有精確流體控制的基于液滴的抗真菌分析平臺的設(shè)計和表征，作為嚴(yán)格、可重復(fù)、單孢子包封和抗真菌分析的新基準(zhǔn)。

結(jié)果

將單個孢子封裝在微流體液滴中

通過將一層聚二甲基硅氧烷 （PDMS） 粘合到載玻片上，將微通道壓印到表面 50 μm 上，構(gòu)建了單孢子封裝的裝置。通過將結(jié)構(gòu)化的PDMS表面粘合到載玻片上，創(chuàng)建了通道和兩個入口，第一個用于油（含表面活性劑），第二個用于孢子懸浮液（半強度PDB）。半強度PDB用于避免孢子萌發(fā)的變異性。噴嘴的尺寸為50μm，液滴是通過用兩股含有表面活性劑的氟化油流對水流進行流動聚焦而產(chǎn)生的（圖2a）。所設(shè)計的芯片能夠在油中PDB中產(chǎn)生單分散液滴，并在PDB中封裝互花格孢的單個孢子（圖2a，b）。為了設(shè)定單孢子包封的最佳條件，測試了油和孢子懸浮液的各種壓力。發(fā)現(xiàn) 100 μm 的液滴大小最適合單個互花米孢子的萌發(fā)，同時在孵育 24 小時后為菌絲生長留出足夠的空間（圖 4b、c）。將單個孢子封裝在液滴中允許支鏈菌絲網(wǎng)絡(luò)在液滴中生長長達 24 小時。包封后4 h和24觀察生長。包膜的孢子在萌發(fā)、細胞壁發(fā)育或菌絲生長方面沒有表現(xiàn)出任何異常（圖2c）。將液滴從芯片外收集在裝滿油和表面活性劑的小瓶中。液滴尺寸系數(shù)變化（CV）為1%（即單分散液滴）。CV是表示液滴單分散性或多分散性的系數(shù)變化。值得注意的是，液滴的大小和頻率通常取決于所用液體的壓力、流速和粘度。圖2d顯示了施加在兩種液體上的壓力所產(chǎn)生的液滴大小。

用于片上抗真菌分析的微流控平臺

抗真菌分析平臺包括OB1流量控制器、管路、連接器、50 mL聚苯乙烯管、聚碳酸酯（PC）微流控芯片（疏水通道）和用于觀察的光學(xué)顯微鏡（圖3a）。OB1 壓力控制器用于以高通量可靠地產(chǎn)生單分散液滴 （CV < 3%）。由于PDMS可能吸收小疏水分子，如孢子衍生的生物分子和藥物，這些芯片用于對系統(tǒng)中的孢子進行活力測定，并優(yōu)化液滴尺寸以進行封裝。對于最終的微流控分析平臺，使用了由PC制成的芯片（圖3b）。市售芯片由兩個不同的部分組成：（1） 液滴制造器和 （2） 液滴存儲位置（總共 2261 個）。滴劑制造器允許用特定濃度的殺菌劑封裝單個孢子（圖 3c）。微流控芯片的結(jié)構(gòu)旨在通過合并兩股水流來通過流體動力流聚焦產(chǎn)生液滴：一種攜帶孢子懸浮液，另一種攜帶特定濃度的殺菌劑。含有孢子懸浮液和抗真菌劑（kunshi）的培養(yǎng)基PDB分別以200 mbar泵送，同時以210 mbar HFE7500濃度泵送氟化油+ 1%v/v表面活性劑，微調(diào)壓力允許水性流體1：1混合。將得到的 100 μm 大小的液滴捕獲在芯片上的特定存儲位置孵育 24 小時 （Fig. 3d–g）。誘捕器允許在孵育4小時和24小時時觀察每個孢子的可視化。每小時產(chǎn)生103個液滴（直徑為100μm）×液滴的通量為5.4個（油壓=210mbar，孢子懸浮壓力=200mbar，殺菌劑壓力=200mbar）。根據(jù)泊松分布定律，每滴平均孢子數(shù)（λ）為0.01，單孢子滴為70個（n=12），占有率為0.03%。具有兩個孢子的液滴數(shù)量為8個（n = 12），占有率為0.003%。無孢子的液滴數(shù)量為2183個（n = 12），空液滴占有率為0.965%。在t = 0 h（100μm），t = 4 h（99.97μm）和t = 24 h（99.47μm）時計算液滴大小。在實驗過程中，通過提供培養(yǎng)基和無菌環(huán)境，在液滴內(nèi)保持最佳生長條件。

該平臺通過將單個孢子封裝在具有特定濃度的坤孢的液滴中，評估坤石對鏈格孢菌孢子萌發(fā)的抗真菌功效?？偣彩褂昧似叻N不同濃度的昆氏，范圍從0.015到6μgμL?1。6 μg μL?1 的劑量在孵育 4 h 和 24 h 后萌發(fā)最多減少 98.6%，顯著高于對照組 （P < 0.05）。在0.015 μg μL?1濃度下，孢子萌發(fā)減少最少（6.9%），顯著高于對照組（P < 0.05）。與對照組相比，所有濃度（孵育后4小時和24小時）均表現(xiàn)出顯著高的抑制百分比（P < 0.05）（圖4a，b）。此外，每個濃度的4和24 h時間點之間的抑制百分比彼此之間沒有顯著差異（P < 0.05）。

與殺菌劑孵育4 h和24 h后，坤石對互花米草孢子萌發(fā)的抗真菌活性表現(xiàn)為EC50（中位抑制濃度）。資料顯示，坤石對鏈格孢菌孢子萌發(fā)具有劑量依賴性抗真菌活性。在4小時和24小時的時間點，EC50的總值范圍為0.125至0.25μgμL-1（表1）。

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